Verso il citofono portatile arcobaleno con diodi laser per la diagnostica globale delle malattie

Rapporti scientifici volume 12, numero articolo: 8671 (2022) Citare questo articolo

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In vivo, Cytophone ha dimostrato la capacità di diagnosi precoce di cancro, infezioni e disturbi cardiovascolari attraverso il rilevamento fotoacustico di marcatori di malattie circolanti direttamente nel flusso sanguigno con un miglioramento della sensibilità di 1.000 volte senza precedenti. Tuttavia, è urgentemente necessario un citofono con specificità e portabilità più elevate. Qui presentiamo una nuova piattaforma Cytophone che integra una serie di diodi laser multispettrali in miniatura, codifica tempo-colore ed elaborazione del segnale risolta in tempo ad alta velocità. Utilizzando diodi laser a due colori (808 nm/915 nm), abbiamo dimostrato l'identificazione spettrale di coaguli bianchi e rossi, cellule di melanoma ed emozoina negli eritrociti infetti dalla malaria su uno sfondo sanguigno e artefatti. I dati di un modello murino di Plasmodium yoelii e di P. falciparum umano in coltura sono stati verificati in vitro con microscopia confocale fototermica e fluorescente. Con queste tecniche, abbiamo rilevato cellule infette entro 4 ore dall’invasione, il che rende l’emozoina promettente come marcatore spettralmente selettivo nelle prime fasi della progressione della malaria. Insieme ai risultati della nostra precedente applicazione del Cytophone con laser convenzionali per la diagnosi di melanoma, batteriemia, anemia falciforme, trombosi, ictus e forme anomale di emoglobina, questa scoperta attuale suggerisce il potenziale per lo sviluppo di un Cytophone arcobaleno portatile con laser multispettrale diodi per l'identificazione di queste e altre malattie.

Sono stati compiuti progressi significativi nella diagnosi delle malattie utilizzando laser avanzati1. Tra i diversi metodi laser, le tecniche fotoacustiche (PA) hanno mostrato vantaggi in termini di sensibilità, non invasività e penetrazione in profondità nel biotessuto fino a 3-5 cm2,3,4. Diversi dispositivi di imaging PA hanno dimostrato risultati clinici promettenti in vivo negli esseri umani, inclusa la valutazione dello stato della malattia di Crohn5, la diagnosi del cancro al seno6,7 e il monitoraggio dell'ossigenazione del sangue nelle vene giugulari8. La diagnosi di queste e di molte altre condizioni mediche spesso inizia con l'esame del sangue del paziente; tuttavia, gli esami del sangue esistenti non sono in grado di fornire una diagnosi precoce perché la loro sensibilità è limitata dal piccolo volume di sangue raccolto (tipicamente 5-10 ml per i campioni venosi e pochi μL per i campioni capillari), che non rilevano fino a 103-104 cellule anomale o biomarcatori nell'intero volume del sangue (~ 5 L negli adulti)9. Questa grande porzione di cellule mancanti può provocare la progressione di una malattia troppo difficile da trattare, come metastasi, sepsi o ictus formati rispettivamente da cellule tumorali circolanti (CTC), batteri e coaguli9,10. In particolare, nonostante gli enormi sforzi nello sviluppo di diversi test CTC, questi non sono ancora raccomandati per l'uso clinico a causa della loro bassa sensibilità, dei dati incoerenti e, di conseguenza, hanno un valore diagnostico poco chiaro, soprattutto per la diagnosi precoce delle malattie10,11. Inoltre, la maggior parte delle tecniche PA esistenti, in particolare l'imaging PA, non sono in grado di rilevare biomarcatori di malattie circolanti in rapido movimento con velocità tipiche comprese tra 5 e 10 cm/s, anche se presenti nei vasi sottocutanei, limitando ulteriormente la loro utilità10.

Queste restrizioni possono essere risolte valutando volumi di sangue più grandi in vivo, utilizzando il principio della citometria a flusso in vivo con metodi di rilevamento fluorescente, fototermico (PT), Raman e soprattutto PA e le loro combinazioni11,12,13. Tra questi metodi, la citometria a flusso PA in vivo (PAFC) ha dimostrato rilevanza clinica per la rilevazione diretta nel flusso sanguigno di batteri (ad esempio, S. aureus ed E. coli), coaguli, cellule falciformi, esosomi, diverse forme di emoglobina (Hb ) (ad es. ossi-, deossi- e meta-Hb), nanoparticelle (NP) e CTC che utilizzano PA intrinseci (ad es. melanina, Hb, Hz [emozoina], citocromi, carotenoidi) o artificiali (ad es. NP d'oro) agenti di contrasto9,12,14,15,16,17,18,19,20. In uno studio clinico, il PAFC ha offerto un miglioramento della sensibilità senza precedenti di circa 1.000 volte rispetto ai metodi diagnostici esistenti per il rilevamento di CTC, coaguli ed emboli di coaguli di CTC nei pazienti con melanoma in vivo21. Abbiamo anche dimostrato che il PAFC in vivo ha il potenziale per rilevare cellule circolanti infette da malaria murina in un modello animale con un livello di parassitemia dello 0,0000001%14,15.

5% parasitemia, they were synchronized with a 5% sorbitol solution to include only 0 to 12-h post-infection ring-stage parasites. These culture plates were monitored until parasites reached the late schizont stage, at which point a 60% Percoll gradient was used to separate the schizont-stage parasites. The collected schizont parasites were reintroduced to a new culture plate with uninfected human erythrocytes and allowed to incubate for 4 h. These P. falciparum cultures were synchronized with a 5% sorbitol solution to create plates containing only 0 to 4-h post-infection ring-stage parasites. The synchronized P. falciparum cultures were monitored for the next 48 h with a serial sampling of the culture every 6 h to prepare thin and thick blood smear microscopy slides for analysis. Nine total samples were taken of the synchronized cultures, including the following time points after erythrocyte infection: 0–4 h, 6–10 h, 12–16 h, 18–22 h, 24–28 h, 30–34 h, 36–40 h, 42–46 h, and 48–52 h./p>